Τα εργαλεία επεξεργασίας CRISPR/Cas προωθούν ραγδαία τις ακριβείς τροποποιήσεις γονιδιώματος, επιτρέποντας ένα ευρύ φάσμα θεραπευτικών εφαρμογών και διαγνωστικών για ανθρώπινες ασθένειες.
Πέρα από την ανθρώπινη υγεία, οι εφαρμογές CRISPR/Cas στη γεωργία είναι ίσως λιγότερο γνωστές. Παρ' όλα αυτά, οι ερευνητές αξιοποιούν όλο και περισσότερο τη δύναμη του CRISPR/Cas9 για την επεξεργασία γονιδίων φυτών, με στόχο τη βελτίωση της αποδοτικότητας των καλλιεργειών, εξασφαλίζοντας βιώσιμες πηγές τροφίμων για τον συνεχώς αυξανόμενο παγκόσμιο πληθυσμό μας.
Τι είναι το ωίδιο
Το ωίδιο, η υπόλευκη σκόνη που μπορεί να εμφανιστεί σε φύλλα, βλαστούς, άνθη, ακόμη και καρπούς, είναι μια μυκητιακή ασθένεια που επηρεάζει ένα ευρύ φάσμα φυτικών ποικιλιών παγκοσμίως. Με πάνω από 650 γνωστά είδη, οι μυκητιασικές λοιμώξεις από ωίδιο προκαλούν χάος στις αλυσίδες εφοδιασμού τροφίμων, καταστρέφοντας και μειώνοντας την παραγωγή κρίσιμων καλλιεργειών, όπως το κριθάρι και το σιτάρι.
Η ευρέος φάσματος φυσική αντοχή σε αυτόν τον τύπο μυκητιασικής λοίμωξης ανακαλύφθηκε τη δεκαετία του 1940 και συνδέθηκε με μια μετάλλαξη απώλειας λειτουργίας στον τόπο αντοχής στο ωίδιο o (mlo) του κριθαριού. Έκτοτε, η αντοχή που βασίζεται στο mlo έχει εντοπιστεί και εισαχθεί σε πολλές φυτικές ποικιλίες για την ευρεία και μακροχρόνια προστασία της (Acevedo-Garcia et al. 2014, Kusch and Panstruga 2017).
Σχηματική αναπαράσταση της πρωτεΐνης HvMLO κριθαριού
«Σχηματική αναπαράσταση της πλήρους πρωτεΐνης HvMLO κριθαριού. Η πορτοκαλί ράβδος αντιπροσωπεύει τη φυτική μεμβράνη. Οι χρωματιστές κουκκίδες υποδεικνύουν τα αμινοξέα των αντίστοιχων μεταλλάξεων mlo σε διαφορετικά είδη φυτών.» Ανακτήθηκε από Yan et al. 2021 (https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/ ). Η οικογένεια γονιδίων mlo κωδικοποιεί ενσωματωμένες πρωτεΐνες μεμβράνης που έχουν επτά τομείς που εκτείνονται στη μεμβράνη. Η ακριβής βιοχημική λειτουργία των πρωτεϊνών MLO δεν είναι πλήρως γνωστή. Παρ' όλα αυτά, πιστεύεται ότι παίζουν ρόλο στην σηματοδότηση που εξαρτάται από το ασβέστιο και την καλμοδουλίνη.
Ακριβής επεξεργασία γονιδίων mlo με CRISPR/Cas9
Τα γονίδια των γονιδίων ευαισθησίας των φυτών (S), όπως η οικογένεια γονιδίων mlo, μπορούν να τροποποιηθούν για να προκαλέσουν αντοχή στα παθογόνα. Στην πραγματικότητα, οι μεταλλάξεις του γονιδίου S με απώλεια λειτουργίας είναι γνωστό ότι προστατεύουν από ένα ευρύ φάσμα παθογόνων. Παρ' όλα αυτά, ένα κοινό μειονέκτημα των μεταλλάξεων με απώλεια λειτουργίας mlo είναι η επακόλουθη αρνητική επίδραση στην ανάπτυξη και την παραγωγικότητα των φυτών. Αυτή η προειδοποίηση έχει αποτρέψει την ευρεία εφαρμογή των μεταλλάξεων με απώλεια λειτουργίας mlo στη γεωργία.
Η επεξεργασία γονιδίων που καθίσταται δυνατή από το CRISPR/Cas9 επιτρέπει στους ερευνητές να εισάγουν ακριβείς αλλαγές στα γονίδια mlo για να αξιοποιήσουν τα οφέλη της αντοχής στο ωίδιο, διατηρώντας παράλληλα τη βέλτιστη ανάπτυξη και τις ιδιότητες απόδοσης των φυτών. Αυτή η προσέγγιση έχει αξιοποιηθεί πρόσφατα από το εργαστήριο της Δρ. Caixia Gao στο Κρατικό Βασικό Εργαστήριο Μηχανικής Φυτικών Κυττάρων και Χρωμοσωμίων, Ινστιτούτο Γενετικής και Αναπτυξιακής Βιολογίας, Ακαδημία Καινοτομίας για Σχεδιασμό Σπόρων, Κινεζική Ακαδημία Επιστημών, Πεκίνο, Κίνα (Li et al. 2022).
Προηγουμένως, η ομάδα του Δρ. Caixia Gao είχε αναπτύξει μια μεταλλαγμένη ποικιλία σιταριού (Triticum aestivum-Ta) που δεν είχε την έκφραση όλων των ομολόγων TaMLO1, τα οποία κωδικοποιούνται από τα γονίδια A , B και D. Παρ 'όλα αυτά, μαζί με την ισχυρή αντοχή στο ωίδιο, η προκύπτουσα μεταλλαγμένη ποικιλία, Tamlo-aabbdd , κληρονόμησε ορισμένες ανεπάρκειες στην ανάπτυξη και την παραγωγικότητα.
Τυχαία, η ομάδα του Gao εντόπισε ένα διαφορετικό μεταλλαγμένο στέλεχος σιταριού που προκαλείται από το Talen και το οποίο άνθισε καλύτερα διατηρώντας παράλληλα ισχυρή αντοχή στο ωίδιο. Ψάχνοντας βαθύτερα, η ομάδα βρήκε μια μεγάλη διαγραφή 304 kb που επεκτάθηκε στο δεύτερο εξόνιο του γονιδίου TaMLOB1 στο νέο μεταλλαγμένο στέλεχος mlo σιταριού που ονόμασαν Tamlo-R32.
Είναι ενδιαφέρον ότι η ομάδα διαπίστωσε ότι η μεγάλη διαγραφή προκάλεσε σημαντικά την έκφραση του TaTMT3B, ενός γονιδίου που βρίσκεται αμέσως πριν από τη διαγραφή και ως επί το πλείστον έχει σιωπήσει σε φυτά σιταριού άγριου τύπου. Επιπλέον, μέσω τοπικής ανάλυσης χρωματίνης και μεταγραφής, η ομάδα του Gao εντόπισε αλλαγές στη διαμόρφωση της χρωματίνης, τους δείκτες (δηλαδή, H3K27me3 και H3K27ac) και την πυκνότητα μεταγραφής, οι οποίες ενίσχυσαν τη μεταγραφική δραστηριότητα εντός της θέσης TaTMT3B.
Στη συνέχεια, αξιοποιώντας την εξειδίκευση της επεξεργασίας γονιδιώματος με βάση το CRISPR/Cas9, η ομάδα του Gao αφαίρεσε το γονίδιο TaTMT3B από τα μεταλλαγμένα φυτά Tamlo-R32. Αυτή η προσέγγιση τους επέτρεψε να αποδείξουν τον κρίσιμο ρόλο του TaTMT3B για τις επιθυμητές ιδιότητες των φυτών, καθώς ελλείψει αυτού, τα φυτά που προέκυψαν εμφάνισαν μειωμένη ανάπτυξη και παραγωγικότητα. Ως εκ τούτου, η υπερέκφραση του TaTMT3B στα τριπλά μεταλλαγμένα φυτά τους, Tamlo-aabbdd , απέτρεψε τους ανεπιθύμητους φαινοτύπους διατηρώντας παράλληλα την αντοχή στο ωίδιο. Τελικά, η ομάδα του Gao εφάρμοσε τις ανακαλύψεις της και το σύστημα CRISPR/Cas9 για να αναπτύξει νέες ποικιλίες σιταριού που φιλοξενούσαν τις ευεργετικές διαγραφές (δηλαδή, διαγραφή 304 kb του γονιδιώματος TaMLO-A1 , TaMLO-D1 και Β).
Η επεξεργασία γονιδιώματος με βάση το CRISPR/Cas9 επιταχύνει τη διαδικασία ανάπτυξης νέων φυτικών ποικιλιών, ένα σαφές πλεονέκτημα έναντι των πιο χρονοβόρων παραδοσιακών στρατηγικών εισαγωγής ή διασταύρωσης. Ενώ τα εργαλεία επεξεργασίας γονιδίων CRISPR/Cas9 που χρησιμοποίησε η ομάδα του Gao περιελάμβαναν τόσο πλασμίδια Cas9/sgRNAs που προέρχονται από την GenScript όσο και σύμπλοκα ριβονουκλεοπρωτεϊνών (RNP) , η χρήση συμπλεγμάτων RNP παρείχε το πλεονέκτημα της εξάλειψης της πιθανότητας γονιδιωματικής ενσωμάτωσης.
Πηγές
Acevedo-Garcia, J., Kusch, S. & Panstruga, R. Μαγική μυστηριώδης περιήγηση: Πρωτεΐνες MLO στην φυτική ανοσία και όχι μόνο. Journal of Physiology (2014) doi:10.1111/nph.12889 .
Kusch, S. & Panstruga, R. Ανθεκτικότητα βασισμένη στο Mlo: Ένα προφανώς καθολικό «όπλο» για την καταπολέμηση της ωιδίου. Molecular Plant-Microbe Interactions (2017) doi:10.1094/MPMI-12-16-0255-CR
Li, S., Lin, D., Zhang, Y. et al. Ανθεκτικότητα σε ωίδιο με γονιδίωμα επεξεργασμένη στο σιτάρι χωρίς αρνητικές επιπτώσεις στην ανάπτυξη. Nature 602, 455–460 (2022). https://doi.org/10.1038/s41586-022-04395-9
Yan, Z. et al. Ανακάλυψη και χαρακτηρισμός ενός νέου μεταλλαγμένου στελέχους mlo ντομάτας από έναν πληθυσμό micro-tom που έχει υποστεί μεταλλαξιογένεση στο ems. Genes (Βασιλεία). (2021) doi:10.3390/genes12050719 .